Исследование крови методом ПЦР

ПЦР – искусственная методика амплификации ДНК.

Способна обнаружить различные воспалительные и инфекционные заболевания на самом раннем сроке развития, до появления первых клинических признаков.

ПЦР представляет собой особый диагностический способ, который делится на несколько этапов:

• Денатурация (плавление)
• Гибридизация праймеров (отжиг праймеров)
• Элонгация

Денатурация

Во время денатурации термоблок нагревают до 94-96 °С, чтобы растворить двойные спиральные цепи водородных связей.

В конце фазы денатурации последовательности ДНК и праймеры должны присутствовать в виде отдельных цепей.

Отжиг праймеров

После денатурации блок охлаждают в течение 30 секунд, это позволяет праймерам связаться с одноцепочечной матрицей.

Дальнейший отжиг проводят при температуре, которая составляет от 55 до 65 ° C.

Элонгация

После того, как была синтезирована новая цепь, температуру снова повышают.

В этом случае до определенной рабочей температуры ДНК-полимеразы (между 68 и 72 ° C), которая теперь начинает амплифицировать ДНК.

Продолжительность этой фазы, в свою очередь, зависит от длины воспроизводимой цепи, обычно длиться от 6 до 11 минут.

На сегодня существует более 10 разновидностей полимеразной реакции.

Однако в лабораторной практике чаще прибегают к качественному определению ПЦР и Real-time PCR.

 Как подготовиться к ПЦР крови

Подготовка является достаточно важным момент в исследовании любого биологического материала.

Соблюдая простые рекомендации, пациент повышает шансы получения максимального точного результата.

Подготовка к ПЦР и правила сдачи крови, следующие: 

• Взятие биологического материала — крови, проводится в утреннее время, до 11-12 часов, на пустой желудок.
• За час до посещения лаборатории разрешается выпить стакан очищенной воды без газа.
• За 5-7 дней необходимо исключить прием медикаментозных средств. В случае невозможности отмены приема лекарства, об этом следует сообщить до взятия крови.
• Забор материала для диагностики ПЦР желательно проводить до начала других исследований.

ПЦР крови в диагностике гепатита

В последнее время анализ крови на гепатиты методом полимеразной реакции (ПЦР) все чаще назначается пациентам с подозрением на заболевание.

Анализ крови на гепатит методом ПЦР дает возможность решить такие задачи:

• Выявить протекающий инфекционный процесс на раннем сроке развития, в период сероконверсионного окна — до появления в организме антител.
• Уточнить отсутствие вирусной патологии, когда другие иммуноферментные анализы предоставили неоднозначные результаты.
• Обнаружить вирусоносителя среди серопозитивных пациентов.
• Дает возможность точно определить тип гепатита.

Полимеразная реакция определяет ДНК вируса путем исследования образца венозной крови или пунктата печени.

Диагностика может определить гепатит как количественно, так и качественно.

Количественный анализ крови способом ПЦР дает понять врачу о вирусной нагрузке на организм, определяя количество частиц вируса.

Интерпретация (расшифровка) ПЦР крови на гепатит В или С может быть следующей:

Положительный результат 

• Вируснаходится в стадии обострения или протекает в хронической форме. Выявление «дикого» штамма вируса.
• Заражение вирусом гепатита В или С мутантного типа. (HBsAg: отрицательно, анти-HBcor: положительно).
• Ложноположительное заключение (анти-HBcor: отрицательно).

Отрицательный результат

• На данный момент инфицирование вирусом отсутствует.
• Пребывание острой формы вируса в инкубационном периоде.
• Период восстановления/выздоровления.

Исследование крови на гепатит методом ПЦР рекомендуется в случае:

• Повышения уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартат-аминотрансферазы (АсАТ), выявленного в ходе биохимического анализа крови.
• Как часть обследования перед подготовкой к зачатию или хирургическому вмешательству.
• Когда пациент регулярно подвергается инъекциям внутривенного характера.
• Если у пациента был незащищенный сексуальный контакт, особенно при наличии подозрений о протекающем вирусе у партнера.
• Если у пациента присутствуют клинические признаки заболевания.

Анализ крови на гепатит С и другие типы методом ПЦР проводится с использованием метода Real-Time.

Провести диагностику уже можно спустя 14 дней после предполагаемого инфицирования.

ПЦР крови на герпетическую инфекцию 1-2 типа

Основные показания к сдаче ПЦР крови на герпес следующие:

• Наличие острой стадии инфекционного процесса, выраженные клинические признаки.
• Как часть исследования при подготовке к беременности или экстракорпоральному оплодотворению.
• Обнаружение плацентарной недостаточности или признаков герпетического заражения плода.
• При наличии у больного острых иммунодефицитных состояний, в том числе ВИЧ, при диагностировании заболеваний, имеющих клетки лимфоидной природы.
• В качестве дифференциального исследования инфекций урогенитального тракта.
• При появлении высыпаний в виде пузырьков неясной этиологии, без присутствия других клинических признаков заболевания.

Герпес первого и второго типа являются наиболее распространенными формами инфекции.

Оба типа рассматриваются как контагиозные заболевания, способные передаваться от одного человека к другому.

Герпетическая инфекция, вызванная первым типом, проявляется в виде пузырькового высыпания на губах.

Второй тип представляет собой инфекцию генитального характера, где основная локализация высыпаний — внешние половые органы.

В данном случае основной путь передачи — половой контакт, при этом, использование презерватива не дает гарантию защиты.

Расшифровка анализа полимеразной реакции на герпес:

• Положительно: в организме имеется инфекция Herpes simplex.
• Отрицательно: в организме отсутствует инфекция Herpes simplex.

Следует обратить внимание, что в редких случаях анализ крови методом ПЦР может предоставить ложноположительный результат.

Как правило, подобное случается при прохождении противовирусной терапии, что способствует снижению концентрации вируса в образце крови.

Анализ крови ПЦР методом на туберкулез

Туберкулез (ТБ) — это инфекционное заболевание, вызываемое бактериями из семейства микобактерий, которое насчитывает более 160 различных типов.

Безусловно, самой распространенной причиной туберкулезных инфекций у людей является микобактерия туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis), обнаруженная Робертом Кохом.

Есть также несколько других видов бактерий, которые могут вызвать туберкулез, среди них, M. bovis и М. аfricanum.

Инкубационный период, то есть период до появления признаков туберкулеза после заражения занимает от шести до восьми недель.

Диагностика туберкулеза может быть осложнена из-за отсутствия выраженной клинической картины или присутствия неспецифических симптомов.

Длительный кашель, особенно в сочетании с ночным потоотделением и отхаркиванием, может указывать на туберкулез, особенно при наличии определенных факторов риска.

Прорывов в диагностике Mycobacterium tuberculosis является полимеразная реакция.

Она позволяет определить инфекцию на самой ранней стадии развития, когда патоген только начинает атаковать организм.

Суть методики ПЦР — выделить ДНК Mycobacterium tuberculosis из образца крови пациента, классифицируя микроорганизм.

Кроме того, анализ может выявить стадийность инфекционного процесса, что позволит определиться с терапевтической тактикой.

Анализ крови на туберкулез методом ПЦР не назначается пациенту, который проходит или недавно прошел лечение от данного заболевания.

Данная рекомендация связана с высоким риском получения ложноположительного результата.

Поскольку даже после терапии некоторое количество бактерий остается в организме.

Анализ крови на ВИЧ методом ПЦР

Вирус иммунодефицита человека или сокращенно ВИЧ, является одним из самых известных и угрожающих инфекционных заболеваний с момента его открытия в 1980-х годах.

Несмотря на тот факт, что до сих пор проводятся исследования относительно лечения ВИЧ, не существует пока лекарства или вакцины против данного вируса.

Игнорирование терапии ВИЧ-инфекции неизбежно приводит к СПИДу — синдрому приобретенного иммунодефицита.

За последние 30 лет ВИЧ стал настоящей пандемией, унесшей жизни около 28 миллионов человек.

Поэтому, своевременная диагностика вируса позволит минимизировать риски перехода заболевания в СПИД-стадию, что значительно продлит жизнь пациенту.

Особое значение в исследовании вируса иммунодефицита человека имеет полимеразная реакция — ПЦР.

Особенно диагностика важна в педиатрии, где в принципе невозможно обнаружить раннее течение вируса у детей без применения ПЦР.

Данное явление связано с тем, что ребенок, родившийся от матери с подобной патологией, уже имеет антитела к вирусу.

Полимеразная цепная реакция дает возможность провести дифференциальное исследование ВИЧ-статуса у новорожденного.

При проведении ПЦР в первые два дня и получении положительного результата, будет говорить об инфицировании ребенка еще в утробе матери.

Если результат получен отрицательный, но в течение двух недель после повторного анализа стал положительным — заражение произошло в момент прохождения плода по родовому пути.

Количественный анализ на ВИЧ проводится пациентам в качестве мониторинга терапии.

Диагностика позволяет обнаружить количество копий рибонуклеиновой кислоты, таким образом, определяя эффективность терапевтического воздействия.

На какой день после заражения анализ крови методом ПЦР может обнаружить ВИЧ?

Выявить присутствие в организме вируса можно спустя 5-10 дней после контакта с партнером, имеющим положительный статус ВИЧ.

Отрицательный результат считается достоверным в случае, если он был проведен спустя две недели после контакта с больным.

Однако дополнительно потребуется проведение ИФА.

Обнаружение Staphylococcus методом ПЦР

Staphylococcus aureus (S. aureus) является факультативно-патогенной бактерией высокой клинической значимости.

Может вызывать тяжелые инфекции, такие как сепсис или эндокардит.

Особенно у людей с ослабленным иммунитетом (например, в контексте химиотерапии, при врожденных иммунодефицитах, сахарном диабете).

Кроме того, увеличение заболеваемости мультирезистентными штаммами Staphylococcus aureus (MRSA) затрудняет успешное лечение антибиотиками.

Диагностика MRSA сегодня проводится микробиологическими и референтными лабораториями (учреждения, которые проводят тестирование в конкретной официальной области исследований).

Сегодня все чаще прибегают к использованию полимеразной реакции количественного типа или в реальном времени.

Анализ крови методом ПЦР на стафилококковую инфекцию позволяет быстро обнаружить патоген и определить штамм резистентного Staphylococcus.

В момент лечения или после него, пациенту может быть назначена молекулярная диагностика методом ПЦР Real-time для определения количественной концентрации патогена.

Анализ ПЦР на паразитарные инфекции

Сразу стоит отметить, что анализ крови методом полимеразной реакции (ПЦР) на обнаружение паразитов, эффективен не для всех видов патогенных микроорганизмов.

Наиболее высокая чувствительность метода отмечается при диагностике следующих паразитарных инфекций:

• Амебиаз

Амебная дизентерия вызвана амебой Entamoeba histolytica.

Инвазивный амебный колит и амебный абсцесс печени.

Не очень распространенные, но потенциально опасные для жизни заболевания среди путешественников в странах с низким уровнем социально-экономического развития.

Амебная дизентерия, также известная как амебиаз, часто протекает бессимптомно, симптомы варьируют от легкой диареи до тяжелой дизентерии.

Основная диагностика заключается в исследовании кала, в частности микроскопия опытной лабораторией, в результате которой можно обнаружить амебные цисты.

В последнее время все чаще прибегают к ПЦР для обнаружения ДНК патогена.

Полимеразная цепная реакция относительно E. histolytica имеет высокую специфичность.

Однако не может определить острое течение паразитарной инфекции от носительства.

• Токсоплазмоз 

Инфекционная болезнь, вызванная паразитом Toxoplasma gondii.

Человек действует как промежуточный хозяин возбудителя; конечным хозяином являются кошки.

При здоровой иммунной системе симптомов обычно нет, только иногда признаки гриппа и опухшие лимфатические узлы. Диагностика — анализ на антитела к токсоплазме, возможно, прямое обнаружение патогенных микроорганизмов при помощи ПЦР.

Получение положительного результата при анализе крови говорит о присутствие в организме острого токсоплазмоза.

Тем не менее, отрицательный результат не дает гарантии, что патогена в организме нет.

Скорее всего, следует тестировать другой биологический материал.

Беременные женщины, которые еще не перенесли токсоплазмозную инфекцию, поэтому не имеют антител к паразиту.

Они должны обратить особое внимание на рекомендуемые профилактические меры.

• Трихинеллез

Трихинеллез является паразитарным заболеванием, вызываемым личинками Trichinella spiralis.

Употребляя в пищу сырое или недостаточно хорошо приготовленное мясо, паразиты могут попасть в организм человека.

Особенно опасна свинина, а также мясо других домашних или диких животных.

Человеческий трихинеллез диагностируется путем обнаружения личинок Trichinella (микроскопия) в биопсии мышц или других биологических материалах.

Часто используется ИФА для обнаружения антител к Trichinella spiralis.

Наиболее современным и часто используемым методом диагностики инфекции является ПЦР.

Метод позволяет обнаружить личинки трихинелл.

Интерпретация результатов исследования простая: «отрицательно» — нет инфекции; «положительно» — заражение имеется.

ИФА или ПЦР: что лучше?

Что собой представляет диагностика крови методом ПЦР, какие отличия от ИФА, и какое исследование выбрать?

Оба вида анализа достаточно широко применяются в лабораторном практике.

Более того, имеют высокую специфичность и точность, которая достигает 98-99%.

Какой именно анализ назначить пациенту, врач решает в индивидуальном порядке.

Нередко может рекомендовать обе диагностика для максимально эффективного мониторинга за состоянием здоровья больного.

Назначение анализа ИФА и ПЦР практически у всех пациентов вызывает множество вопросов.

Поскольку подобный диагностический комплекс кажется одинаковым.

Тем не менее, отличия имеются и вполне существенные.

Так, ИФА позволяет выявить не сам патогенный микроорганизм, а только антитела к нему, которые организм успел выработать.

Тогда как ПЦР определяет непосредственно тип патогена, а также его количество/концентрацию в организме.

Оба анализа являются высокоинформативными и высокоточными методами тестирования инфекционных агентов.

Однако ни ПЦР, ни ИФА нельзя назвать панацеей в исследовании заболеваний вирусной или бактериальной этиологии.

Они являются дополнением к другим лабораторным тестированиям.

Позволяя добиться точного результата при постановке диагноза и определении максимально эффективного лечения.

Для назначения и сдачи анализов крови методом ПЦР обращайтесь к автору этой статьи – венерологу в Москве с многолетним опытом работы.